IMPLICANCIA DE UNA ENZIMA GLICOLÍTICA EN LA ENFERMEDAD
DE PARKINSON

Dr. César L. Ávila (Dir.); Baleani, M.A.¹, Amzel, M.², Chehín, R.N.¹, Ávila, C.L.¹. ¹Instituto
de Investigación en Medicina Molecular y Celular Aplicada (IMMCA), ²Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD 21205, USA

Objetivo: Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) es una enzima glicolítica que presenta además un rol neuroprotector. Este rol estaría asociado a la formación de especies de alto peso molecular en el espacio extracelular luego de la interacción con glicosaminoglicanos (GAGs). El objetivo de este trabajo es caracterizar los determinantes estructurales de los GAGs capaces de desencadenar la formación de agregados de GAPDH para sentar las bases necesarias para la síntesis de un fármaco con actividad neuroprotectora, sin actividad anticoagulante y capaz de atravesar barrera hematoencefálica (BHE).
Metodología: GAPDH fue expresada de manera heteróloga en una cepa de E. coli Rosetta transformada con el plásmido pET-14b y posteriormente purificada por cromatografía de afinidad. La proteina fue cocristalizada con fondaparina y difractada por rayos X. Los datos de difracción se integraron con el paquete XDS y se modeló mediante el software CCP4. Para la determinación de la constante de afinidad (Kd), la determinación de grupos sulfato y triptófanos (TRP) involucrados en la interacción se monitorearon los cambios en la fluorescencia intrínseca de los TRP tanto de la proteína nativa como de mutantes con mutaciones puntuales en los residuos de triptófano.
Resultados: Se determinaron los sitios de contacto del azúcar con la proteína, los distintos anillos de fondaparina interaccionan con los aminoácidos asparagina 41, valina 44, tirosina 45 y 49, glutamina 48, treonina 59, lisina 61, triptófano 196, ácido glutámico 278, glicina 280 e histidina 279. El ensayo de titulación permitió demostrar que la concentración de fondaparina necesaria para alcanzar la mitad del efecto es de 4,4 ng/ml. Por otro lado, para estudiar el grupo sulfato responsable de la interacción se utilizaron distintos disacáridos y se observó que el sulfato 2-N del anillo glucurónico es indispensable para lograr el efecto. Por último, el estudio de fluorescencia con distintas mutantes al triptófano se pudo observar que el triptófano 313 es el responsable de reportar la unión con la molécula de fondaparina.
Conclusión: Por medio del análisis cristalográfico y de fluorescencia se pudieron determinar los sitios de la proteína involucrados en la unión, los grupos sulfato de heparina y la cantidad necesaria para desencadenar el efecto, esto es de importancia para poder brindar la información en el diseño de un fármaco que reúna estas características, que no tenga actividad anticoagulante y que sea capaz de atravesar barrera hematoencefálica.