ESTUDIO DEL PROCESO DE REPARACION TISULAR EJERCIDO POR Lactobacillus plantarum SOBRE ULCERAS DE PIE DIABETICO. MECANISMOS CELULARES Y MOLECULARES

Dra. Mirta Rachid (Dir.); Doctores: Luis Olea¹, Marcela Ortiz Mayor¹, Clara Silva², Nadia Gobbato³, Juan Carlos Valdez, Pablo Valdecantos⁴,; Bioq. Nilda Arias⁵; Lic. Sebastián Nisoria1, Angelina Liezun⁶; Esp. Walter Monjes⁷; Estudiantes Sebastián Romero¹, Rafael Torres Dimani³. 1- Hospital Angel C. Padilla. 2- Cátedra de Bacteriología, Fac. de Bioquímica, Química y Farmacia. U.N.T. 3- Cátedra de Inmunología Fac. de Bioquímica, Química y Farmacia. U.N.T. 4- Cátedra de Biología Celular Fac. de Bioquímica, Química y Farmacia. U.N.T. 5- Laboratorio de Patología Molecular Fac. de Bioquímica, Química y Farmacia. U.N.T. 6- Escuela de Enfermería. U.N.T. 7- Cátedra de Química Fotográfica. Facultad de Artes. U.N.T.

Objetivo: Estudiar los mecanismos celulares por los cuales el tratamiento con L. plantarum favorecería el proceso de cicatrización de úlceras de pie diabético.
Metodología de trabajo: Se trabajo con pacientes diabéticos tipo 2 con presencia de ulceras de miembros inferiores con infecciones polimicrobianas. Los controles fueron pacientes ortopédicos sin ningún otro tipo de patología descripta. Las ulceras fueron clasificadas según la clasificación de Wagner. Criterios de inclusión: pacientes que presentan úlceras de pie diabético resistente a la antibioticoterapia y/o recurrente por al menos 30 días de tratamiento y que concurren al servicio para ser tratados con desbridamiento quirúrgico y by pass.
Tratamiento Alternativo (Bacterioterapia) contó con la autorización del comité de ética del Hospital. Consistió en la aplicación tópica de un cultivo entero en fase log de 105 de Lactobacillus plantarum. Las aplicaciones se realizaron cada 2 días y durante 30 días consecutivos. Se tomaran muestras al tiempo 0 (principio del tratamiento), al día 15 y al final del tratamiento (día 30).
Muestra de biopsias: Las biopsias serán obtenidas del borde y del centro del área de la ulcera y se realizaron las siguientes técnicas:
a) Estudios Bacteriológicos: para identificación y aislamiento de cepas infectivas.
b) Estudios anatomopatológicos: para determinar la presencia de congestión vascular, edema, infiltración celular, tejido de granulación y regeneración tisular.
c) Técnicas de Inmunohistoquímica: estudio de angiogénesis. Presencia de células endoteliales progenitoras (EPCs) CD34+-KDR+ y células endoteliales maduras (CD133+).
d) Dosaje de Proteinasas (Metaloproteinasas): En el exudado se midió los niveles MMP-2 y MMP-9 por técnica de Zimografia en gel de poliacrilamida.
e) Coloración de Gieson: Se estudio el depósito de colágeno en las heridas.
f) Técnica inmunoperoxidasa: para tipificación de macrófagos M1 y M2 con anticuerpos monoclonales.

Estudios in vitro
1) Ensayo de proliferación de fibroblastos: Se aislaron los fibroblastos de biopsias y se cultivaron con cultivos enteros de L. plantarum o sobrenadantes y se midió la actividad metabólica de las células viables con la técnica del XTT.
2) Aislamiento de polimorfonucleares de sangre circulante: de pacientes no diabéticos y diabéticos. Se cocultivaron con L. plantarum y su sobrenadante y se midió Netosis, fagocitosis y actividad microbicida. 3) Actividad antibacteriana de L. plantarum frente a cepas de Staphylococcus aureus aisladas de pie diabético: Técnica de difusión en agar Medio Muller Hinton.

Resultados y Conclusión: La aplicación tópica de un cultivo entero de Lactobacillus plantarum favoreció el proceso de cicatrización de las heridas, disminuyendo la carga bacteriana, y favoreciendo el desarrollo de tejido de granulación y el proceso de angiogenesis. Un balance entre las métaloproteinasas y sus inhibidores están involucrados en la remodelación y reparación del las heridas, y L. plantarum disminuyo la expresión de estas metaloproteinasas en el exudado de las heridas. Se observó una actividad antibacteriana de L. plantarum in vitro, además, favoreció la proliferación de fibroblastos, aumentando su capacidad reproductiva y aumentando el porcentaje de netosis de los polimorfonucleares de los pacientes diabéticos, como un mecanismo de respuesta inmune esencial en los procesos infecciosos.